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免疫學(xué)三大工具—免疫組化（IHC）

免疫組化是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，通過免疫反應(yīng)和顯色反應(yīng)來準(zhǔn)確定位組織和細(xì)胞中的抗原，從而進(jìn)行形態(tài)與功能結(jié)合的研究，對于病理學(xué)領(lǐng)域具有十分重要的意義。




  流程  







 實驗步驟 



1

切片


將包埋好的組織置于石蠟切片機(jī)上進(jìn)行切片，石蠟切片厚度5 μm，切好的組織置于40℃水中展平，隨后用玻片撈出，置于烘箱60℃，烤片30min。


注意：對骨或者皮膚這些易脫片的組織，可適當(dāng)延長烤片的時間。


2

脫蠟至水


目的：為了脫去組織石蠟，讓組織水化，易于孵育。

將玻片連同架子依次放入二甲苯、酒精中進(jìn)行脫蠟，二甲苯脫蠟三缸，每缸10min。100%，85%，70% 酒精依次浸泡10min。


注意：可根據(jù)氣溫適當(dāng)延長或縮短時間。


3

抗原修復(fù)


目的：使抗原位點(diǎn)暴露出來

材料：檸檬酸緩沖液


清水沖洗玻片，然后連同架子放入檸檬酸緩沖液中，在微波爐中煮沸，然后室溫冷卻。

4

封閉


目的：封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)

材料：免疫組化筆


室溫冷卻后將檸檬酸倒掉，并在染色缸中用PSB清洗玻片。用免疫組化筆在玻片上畫圈防止試劑流出，滴加封閉血清，于恒溫箱中37℃孵育30min。


5

一抗二抗孵育


材料：PBS緩沖液


將載玻片取出，倒去血清，滴加一抗，4℃冰箱保存過夜。取出后用PBS清洗玻片。然后同樣操作依次滴加二抗、SABC、顯色劑、并每次用PBS洗滌玻片。


6

復(fù)染


材料：蘇木素染色液


取玻片浸泡于蘇木素染色液中，一般動物組織染30s，植物組織染3-5min，蒸餾水水洗，1%鹽酸酒精中脫色，浸泡水洗。


注意：具體復(fù)染時間根據(jù)染色效果進(jìn)行調(diào)整。


7

脫水


將復(fù)染結(jié)束的玻片依次浸泡于70%，85%，100%酒精中梯度脫水，每缸3min；二甲苯三缸，每缸2min。

8

封片


材料：中性樹脂


最后中性樹脂滴在玻片組織旁進(jìn)行封片，通風(fēng)櫥晾干，觀察實驗結(jié)果及拍照。


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